信帆生物針對WB常見問題在線解答
蛋白質免疫印跡(Western Blot,WB )是很常規(guī)的生物學實驗，是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
1、為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
答：可能的原因有：
1）細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；
2）抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；
3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長；
4）細胞中的蛋白質被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。
2、我的目的帶很弱，如何加強？
答：1）可以加大抗原上樣量，這是主要的；
2）也可以將一抗稀釋比例降低；
3）還可以延長曝光時間。
3、我做的蛋白質分子量很?。?0KD），請問怎么做WB？
答：1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；
2）也可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
4、大分子量蛋白200KD，在做WB要注意什么？
答：1）做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時要小心；
2）轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）；
3）轉膜液甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉膜效率更高哦!
5、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
6、WB中抗體的可以重復應用嗎？
答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。
7、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到佳效果？
答：無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。
8、免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？
答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。
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